可能很多讀者對細(xì)胞的凍存復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)操作與步驟心存疑慮，在這里給大家介紹一些關(guān)于細(xì)胞凍存復(fù)蘇方面的理論知識。

基本概念：存活率與恢復(fù)率

細(xì)胞凍存復(fù)蘇的質(zhì)量可以通過存活率（viability）來衡量。即在細(xì)胞復(fù)蘇、洗滌后，用臺盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。存活率 = 活細(xì)胞數(shù) / 細(xì)胞總數(shù)×100%。經(jīng)臺盼藍(lán)染色，活細(xì)胞呈無色，晶瑩透亮；死細(xì)胞呈藍(lán)色，暗淡無光，直徑比活細(xì)胞大1-2倍。

一般來說，如果細(xì)胞的存活率低于70%，ELISPOT檢測結(jié)果會很糟糕。補(bǔ)救辦法是讓細(xì)胞休息過夜，或者采用預(yù)孵育ELISPOT方法（見4.6節(jié)），檢測結(jié)果會有改善。如果細(xì)胞存活率高于80%會獲得較滿意的ELISPOT結(jié)果。如果嚴(yán)格按本實(shí)驗(yàn)規(guī)范，可以保證存活率達(dá)90%。在此存活率下，復(fù)蘇細(xì)胞可以直接做ELISPOT檢測，不需休息過夜。

與存活率相關(guān)聯(lián)但又有顯著區(qū)別的另一個(gè)概念是恢復(fù)率（recovery）。恢復(fù)率是指凍存、復(fù)蘇之后回收到的活細(xì)胞和凍存前活細(xì)胞的比例。恢復(fù)率的高低取決于兩個(gè)影響因素，即存活率和洗滌丟失比例。使用本試劑盒，細(xì)胞的存活率很高，它對恢復(fù)率的影響可以忽略。所以對恢復(fù)率的主要影響因素是洗滌過程中細(xì)胞的丟失。本操作手冊中有兩步洗滌，推薦的離心條件是400g離心10min，按照這種操作，細(xì)胞的丟失應(yīng)該在可接受的范圍之內(nèi)。同時(shí)我們推薦較高的細(xì)胞凍存濃度，即1x107cells/ml，甚至可以更高。如果細(xì)胞達(dá)不到這種濃度，也至少應(yīng)該達(dá)到5×106cells/ml。

細(xì)胞為什么會被凍死？

使細(xì)胞死亡的原因并不是低溫，相反，低溫可以減緩甚至?xí)和＜?xì)胞生命運(yùn)動，使其長期保存。讓細(xì)胞死亡的真正原因是水。不錯(cuò)，正是水分。水分在冷凍的過程中會結(jié)冰，從而給細(xì)胞帶來雙重傷害。

第一重傷害在于水結(jié)冰的過程。我們知道，冰是一種晶體。結(jié)冰的過程，就是水分子不斷的填充到冰晶的陣列當(dāng)中，使冰晶體不斷長大的過程。看過水晶的人對晶體都會有一種直觀認(rèn)識，那就是晶體有非常分明的棱角，冰晶也是這樣。不論是細(xì)胞內(nèi)、還是細(xì)胞外的冰晶，在生長過程中能夠不斷的外延，很容易就會刺破細(xì)胞的各種生物膜，尤其是質(zhì)膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這是細(xì)胞被凍死的首要原因。

第二重傷害機(jī)制很好理解，那就是水在結(jié)冰的過程中，體積會增加1/10。體積膨脹伴隨的微觀運(yùn)動會使各種水合蛋白原子之間發(fā)生位移，化學(xué)鍵被扭曲，導(dǎo)致蛋白變性失活。各種蛋白制劑要避免反復(fù)凍融就是這個(gè)道理。體積膨脹伴隨的宏觀運(yùn)動會使各種封閉的細(xì)胞器、細(xì)胞核乃至整個(gè)細(xì)胞也跟著膨脹，有可能在膨脹過程中發(fā)生生物膜破裂事件。由水的體積膨脹導(dǎo)致的傷害相對來說居于次要地位。

這兩重傷害是如此的嚴(yán)重，以致于脆弱的哺乳動物細(xì)胞如果不添加保護(hù)劑，幾乎都會在凍融的過程中死亡。那么，凍存保護(hù)劑又是什么東西呢？

凍存保護(hù)劑的原理是什么？

凍存保護(hù)劑分兩類，保護(hù)原理各不相同。第一類稱為細(xì)胞外保護(hù)劑，多是高分子物質(zhì)，比如甲基纖維素，聚乙二醇（PEG），血清白蛋白等等；第二類稱為細(xì)胞內(nèi)保護(hù)劑，比如甘油、二甲基亞砜（DMSO）等等。

第一類保護(hù)劑的作用是分隔細(xì)胞外的溶液空間，阻止細(xì)胞外大冰晶的形成。因?yàn)榧?xì)胞外保護(hù)劑都是高分子，一方面自身會結(jié)合大量自由的水分子，另一方面也會阻止未結(jié)合的自由水分子的運(yùn)動，形成一個(gè)個(gè)相對阻隔的小空間。冰晶的形成與生長就被限定在這樣一個(gè)個(gè)相互阻隔的小空間內(nèi)，不能形成大的冰晶。也就是說，把原先少數(shù)大的冰晶分隔成了無數(shù)細(xì)微的小冰晶，極大地減少了對細(xì)胞膜的威脅。

第二類保護(hù)劑能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，起到雙重保護(hù)效果。第一重保護(hù)效果是保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)，減輕凍融作用對蛋白質(zhì)的損傷。因?yàn)閮?nèi)保護(hù)劑都是親水的小分子，可以取代蛋白質(zhì)表面的水合層，減輕水凍結(jié)膨脹造成的原子位移與化學(xué)鍵破壞。第二重保護(hù)是破壞細(xì)胞內(nèi)冰晶的晶格結(jié)構(gòu)，防止形成大的冰晶刺破細(xì)胞器與質(zhì)膜。我們知道，晶體的生長是組成晶格的原子分子有序點(diǎn)陣堆積的結(jié)果。但是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的這些親水小分子可以取代水分子而堆積到冰晶的晶格中，造成晶體的結(jié)構(gòu)缺陷。缺陷嚴(yán)重到一定程度，晶體就不再增長，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞也就降低了。另外還有證據(jù)表明，像DMSO可以起到水的結(jié)晶核作用，大量的結(jié)晶核相互競爭水分子，導(dǎo)致這些冰晶都長不大。

U-Cytech Cryostar?凍存試劑是各種凍存保護(hù)劑的優(yōu)化與集大成者。重懸液中含有多種細(xì)胞外保護(hù)劑，2倍凍存液含同時(shí)含有細(xì)胞外凍存保護(hù)劑和細(xì)胞內(nèi)凍存保護(hù)劑，可以保證凍存的合適效果。

為什么要慢凍快融？

除了凍存保護(hù)劑之外，冷凍和升溫的速度也直接影響細(xì)胞的存活率。做過細(xì)胞凍存復(fù)蘇的人都可能聽說過“慢凍快融”的原則。這條原則背后的科學(xué)道理是什么呢？

慢凍是為了減少細(xì)胞內(nèi)的水分，從而降低水分結(jié)冰導(dǎo)致的傷害。為了說清這個(gè)道理，需要一點(diǎn)點(diǎn)物理學(xué)知識。我們知道，水溶液結(jié)冰是一個(gè)溶質(zhì)溶劑相互作用的過程。溶液的濃度越高，開始結(jié)冰的溫度（冰點(diǎn)）就越低。溶液結(jié)冰時(shí)，作為溶劑的水優(yōu)先結(jié)冰，同時(shí)把溶質(zhì)外排，這樣就導(dǎo)致溶質(zhì)的濃度越來越高。溶質(zhì)的濃度越高，則剩下的溶液要進(jìn)一步結(jié)冰，需要的溫度就更低，直到一個(gè)最終完全結(jié)冰的溫度（共熔點(diǎn)）。也就是說，水溶液的結(jié)冰是一個(gè)溫度逐漸降低（從冰點(diǎn)最后降低到共熔點(diǎn)）、溶液濃度逐漸升高的過程。

但是這樣的結(jié)冰過程也是有條件的，那就是外界的溫度不能急劇降低，讓溶劑結(jié)冰的時(shí)候，有足夠的時(shí)間把溶質(zhì)排除到冰體之外。否則，溫度降低太快，溶質(zhì)就會被困在溶劑中間一同凝固，這在物理學(xué)上叫玻璃化凝固，而非真正的結(jié)冰。慢凍就是為了讓凍存液真正結(jié)冰，結(jié)冰的過程中，凍存液的濃度會逐漸提高，滲透壓也逐漸提高，細(xì)胞內(nèi)的水分就會逐漸滲透到細(xì)胞外，從而減弱細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰導(dǎo)致的傷害。

理論和實(shí)踐表明，細(xì)胞冷凍的速度控制在每分鐘降低1°C效果好。Nalgene公司的程序降溫盒“Mr. Frosty”放置在-70℃冰箱內(nèi)能夠提供接近于1℃/min的降溫速度。此外還有專門的程序降溫儀也能嚴(yán)格控制凍存細(xì)胞的降溫速率。我們不推薦任何傳統(tǒng)辦法，傳統(tǒng)辦法的人為因素太大，效果不穩(wěn)定。

那么快融又是什么道理呢？快融是為了防止融解過程中的局部區(qū)域發(fā)生反復(fù)凍融。

 DMSO的特殊性所帶來的特殊實(shí)驗(yàn)操作

二甲基亞砜（DMSO）是一種有效的細(xì)胞內(nèi)保護(hù)劑，Cryostar? 2×凍存液含有DMSO。DMSO具有脂溶性，細(xì)胞毒性，密度比水大。正是由于這些特殊性質(zhì)，所以在細(xì)胞凍存復(fù)蘇中會有一些相應(yīng)的特殊操作。

先說脂溶性。DMSO能自由穿越細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子層。穿透的速度取決于細(xì)胞內(nèi)外兩側(cè)的濃度差。如果穿透速度太快，膜結(jié)構(gòu)與膜蛋白都會受到損傷。所以，要控制細(xì)胞內(nèi)外的DMSO濃度差，不能變化太劇烈。一方面，滴加凍存液時(shí)，DMSO的濃度要緩慢增加；另一方面復(fù)蘇洗滌時(shí)，DMSO的濃度要緩慢下降。這就是在凍存和復(fù)蘇程序中多處出現(xiàn)“逐滴加入”“緩慢加入”的原因。

接著說毒性。沒錯(cuò)，DMSO確實(shí)有細(xì)胞毒性！但是它在凍存中能有效保護(hù)細(xì)胞，所以凍存液都離不開DMSO，我們要做的只能是減少DMSO對細(xì)胞的毒性。我們都知道，溫度越低，細(xì)胞的生命活動越弱，對有毒物質(zhì)的耐受就越強(qiáng)。凡是涉及到DMSO的地方我們都會提到“冰上操作”，用低溫來減弱DMSO的毒性，這就是原因所在。

最后說密度。DMSO的密度大于水。Cryostar? 2×凍存液含有DMSO，所以它的密度大于普通培養(yǎng)基和血清。為了獲得充分的混合效果，一方面，在凍存程序中，Cryostar? 2×凍存液要滴加到Cryostar?重懸液液面之上，這樣高密度的Cryostar? 2X凍存液就能靠重力的作用和下面低密度的Cryostar?重懸液有效混合；另一方面，在復(fù)蘇程序中，低密度的血清和RPMI-1640培養(yǎng)基要緩慢加入到高密度凍存液液體的下方，這樣低密度的液體靠浮力作用就能和上方的細(xì)胞凍存液有效混合。