• ELISA試劑盒為什么要平衡至室溫？ 

ELISA試劑盒的溫度平衡對ELISA實驗很重要，需要實驗者引以為重。試劑盒使用前平衡至室溫的意義在于ELISA實驗對溫度敏感。

a.平衡濃縮洗液是為了溶解在2~8℃保存時出現的結晶。只有平衡至室溫并確保結晶完全溶解，才能準確配制洗液的濃度。

b.平衡稀釋液是ELISA實驗在室溫或37度孵育的前提條件。若沒有平衡至室溫，如某些步驟只孵育1小時，甚至20min，那么ELISA實驗反應效率就由于反應溫度過低而大大降低，導致實驗OD值讀數非常低。

c.預包被板的平衡有利于開包裝后剩余預包被板條的保存，預包被板條保存在真空干燥的鋁箔袋中，平衡至室溫后打開鋁箔袋，就可以避免外界的水汽凝結在板條上。同時，拆開包裝的板條要減少在外界暴露的時間，保留干燥劑在袋中，用膠帶或帶封口的塑料袋密閉封口2~8℃保存，在1個月內使用。

• ELISA的標準品如何操作？ 

標準品是試劑盒的檢測抗原的一個度量標尺，因此標準品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細節：凍干標準品溶解按照說明書的要求, 準確復溶。在冰上操作標準品為佳, 靜置5-10min，輕輕搖勻后按照一次量分裝，在-20℃或-70℃保存。標準品嚴禁反復凍融。標準品的倍比稀釋應事先做好準備，如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備；稀釋時，應充分混勻；采用進口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實驗孔內進行倍比稀釋時，注意操作規范，槍頭勿刮劃預包被的孔底。

• ELISA的標準曲線如何擬合？ 

針對不同情況應當如何選擇合適的標準曲線呢？

嘗試使用不同標度繪制曲線，例如對數-對數、5-參數邏輯曲線擬合。

--線性圖：一個坐標軸表示抗原的濃度，另一個表示讀數。R2值在此通常用于確定擬合，數值大于0.99表示擬合非常好。然而，線性圖往往會壓縮曲線下端上的數據點，導致計算結果不準。

--半對數圖：幫助抵消線性圖引起的下端壓縮。半對數圖使用濃度的對數與讀數的關系。這種方法通常會得到數據點分布更均勻的S形曲線。

--對數/對數圖：為低到中濃度范圍提供良好的線性。但范圍的高濃度端則容易失去線性。

--4或5參數邏輯（4PL或5PL）曲線：方法更復雜，考慮了其他參數比如說最 大值和最 小值，因此需要更為復雜的計算。4PL假設拐點周圍對稱，而5PL考慮了不對稱的情況，通常更適合免疫分析。如果您的軟件允許，則4PL和5PL將適用于大部分ELISA校正標準曲線。如果您的軟件不允許，則建議選擇是使用半對數或對數/對數圖。

• ELISA操作中的洗滌要注意哪些？

洗滌是ELISA實驗中最多次數的操作，也是非常重要的步驟。不嚴格的洗滌容易出現洗不干凈或交叉污染現象，導致實驗重復效果差。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機，均需嚴格按照說明書操作，不得減少洗滌步驟、洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數。注意標準化操作將減少實驗誤差。操作者常出現洗板不干凈現象，請比照“手工洗板小貼士”操作：

a.設計實驗的時候要考慮實驗孔的位置，保證甩掉洗液時，空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側，還要注意甩掉洗液的動作要迅速、干脆。

b.洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會增高。

c.用干凈的濾紙，不要用衛生紙，因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導致洗板不干凈，結果偏高或偏低，重復孔的數值也會相差很大。

d.每次拍板不要重復在一個地方拍，特別是洗去酶的步驟；拍板不宜過輕，否則拍不干凈，但注意不要太重，以致把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，最后一次一定要叩干凈。

e.洗板時間（靜置1分鐘）和次數一定要符合要求，洗板時間太短，洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數可以使背景更干凈。

• ELISA實驗中如何判定終止反應的時間？

判定ELISA終止反應時間建議根據孔內顏色的深淺（深藍色）來終止反應，通常顯色10-20分鐘就可以達到很好的效果或直接在610~630nm測定標準曲線最 高濃度對應的吸光值，在0.7~1.0之間即可選擇終止反應。