引導(dǎo)語：

2021年6月23日，中國首款CAR T藥-阿基侖賽注射液獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市。這是一種自體免疫細(xì)胞注射劑，由攜帶CD19 CAR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因修飾的自體靶向人CD19嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR T）制備，用于治療既往接受二線或以上系統(tǒng)性治療后復(fù)發(fā)或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤成人患者，這將開啟中國腫瘤細(xì)胞治療的新未來。

CAR T技術(shù)出現(xiàn)了多年并經(jīng)歷了諸多改進(jìn)才逐漸進(jìn)入臨床，除了被用來治療急性白血病和非霍奇金淋巴瘤，改進(jìn)后也被用來治療實體瘤、自身免疫疾病、HIV感染和心臟病等疾病。近年來，國內(nèi)外已經(jīng)有很多關(guān)于CAR T細(xì)胞的研究和報導(dǎo)。2021年4月2日，在期刊Clinical Cancer Research（影響因子IF=10.107）發(fā)表了一篇標(biāo)題為“A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-Specific CAR T Cells in Solid Tumors”的論文，研究泛組蛋白脫乙酰基酶抑制劑對實體瘤中B7-H3.CAR T細(xì)胞的抗腫瘤活性的影響。

接下來小編就給大家介紹一下這篇高分文獻(xiàn)。

一、B7-H3在實體癌細(xì)胞上的表達(dá)及其與多種實體癌患者生存率的關(guān)系

B7-H3，也稱為CD276，它是一種免疫檢查點分子，屬于免疫檢查點抑制劑B7超家族。它的生物學(xué)特性功能目前尚不清楚，它的功能是共刺激或者共抑制分子取決于它所參與的免疫反應(yīng)。在這篇文章，作者為了測試表觀遺傳療法是否可以增強 B7-H3.CAR T細(xì)胞對多種實體癌類型的抗腫瘤活性，通過in vitro和ex vitro實驗，評估了B7-H3.CAR T 細(xì)胞和脫乙酰酶抑制劑 (SAHA) 聯(lián)合治療幾種實體癌的療效和潛在機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B7-H3 在大多數(shù)人實體瘤樣本中會表達(dá)，但在正常組織中表達(dá)受限，B7-H3.CAR T 細(xì)胞在體外選擇性殺死表達(dá) B7-H3 的人癌細(xì)胞系。

作者采用中山紀(jì)念醫(yī)院和中山大學(xué)自2007年4月至2013年12月期間收集的186例三陰性乳腺癌（TNBC）樣本，298例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）標(biāo)本樣本，152個非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）樣本和89例皮膚黑色素瘤（SKCM）樣本用于B7-H3染色和分析。另外，采用中山紀(jì)念醫(yī)院和中山大學(xué)自2016年5月至2018年11月期間收集的47例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌樣本和39例三陰性乳腺癌樣本建立病人來源的異種移植模型。采用50ml健康獻(xiàn)血者的外周血，以及70ml頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者和三陰性乳腺癌患者的外周血建立這兩種癌癥細(xì)胞系，建議TNBC-S3和HNSCC-Y2細(xì)胞系，以產(chǎn)生CAR T細(xì)胞。

首先，作者評估了B7-H3在實體癌和正常組織中的表達(dá)。如圖1所示，B7-H3廣泛表達(dá)于多種實體癌，但在正常組織有限表達(dá)。低表達(dá)B7-H3的TNBC，HNSCC，以及SCLC癌癥患者的存活率更長。B7-H3表達(dá)升高與腫瘤患者的短存活率有關(guān)。因此，B7-H3不僅是實體癌的一個預(yù)后生物標(biāo)志物，而且是腫瘤免疫治療的一個重要靶點。

圖1：B7-H3在實體癌細(xì)胞上的表達(dá)及其與多種實體癌患者生存率的關(guān)系。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

二、脫乙酰酶抑制劑 (SAHA)可顯著增加多種人實體癌細(xì)胞的B7-H3的表達(dá)

實體瘤中的抗原異質(zhì)性是CAR T細(xì)胞的免疫治療的主要障礙之一。抗原豐富區(qū)域促進(jìn)了CAR T細(xì)胞的招募以及CAR T細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的相互作用。組蛋白脫乙酰基酶抑制劑已經(jīng)被證明可以有效的上調(diào)轉(zhuǎn)錄激活。因此，作者檢測了組蛋白脫乙酰基酶抑制劑是否能增強B7-H3在實體癌細(xì)胞中的表達(dá)。如圖2。考慮到劑量限制毒性和其他臨床試驗中觀察到的與組蛋白脫乙酰基酶抑制劑相關(guān)的不良反應(yīng)，作者篩選了一系列的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAHA可以最有效的上調(diào)B7-H3的表達(dá)，如0.5 mmol/L的SAHA可以誘導(dǎo)B7-H3表達(dá)水平上調(diào)兩倍，并且SAHA可以上調(diào)B7-H3轉(zhuǎn)錄和蛋白水平。同時檢測了B7-H3在經(jīng)SAHA處理的多種正常人細(xì)胞上的表達(dá)，包括原代舌肌細(xì)胞，原代胃上皮細(xì)胞細(xì)胞，原代十二指腸細(xì)胞，原代肝細(xì)胞，原代胰腺細(xì)胞和原代卵巢細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SAHA沒有增加B7-H3在人類正常細(xì)胞表面的表達(dá)。

圖2：SAHA通過組蛋白修飾顯著增加了多種人實體癌B7-H3的表達(dá)。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

三、SAHA可顯著增強實體瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的B7-H3. CAR T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性

如圖3，相比于未預(yù)處理的癌細(xì)胞，SAHA預(yù)處理的CAR T細(xì)胞共培養(yǎng)的癌細(xì)胞，經(jīng)過24小時的孵育后，細(xì)胞上清中四種細(xì)胞因子：GMCSF，IFNγ，IL2和TNFα顯著增加。說明SAHA可增強實體癌細(xì)胞對B7-H3.CAR T細(xì)胞的敏感性，并增強B7-H3.CAR T細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞毒活性。

圖3：SAHA可增強實體癌細(xì)胞對B7-H3.CAR T細(xì)胞的敏感性，并增強B7-H3.CAR T細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞毒活性。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

四、SAHA可抑制B7-H3.CAR T免疫抑制信號通路以及增強蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運信號通路

作者進(jìn)行mRNA分析以檢測B7-H3.CAR T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在SAHA處理下的變化。如圖4，SAHA顯著改變了轉(zhuǎn)錄組，有6172個基因表達(dá)顯著上調(diào)，6225個基因表達(dá)顯著下調(diào)。然后，采用基因富集分析去鑒定CAR T改變的細(xì)胞表型，發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)運輸相關(guān)的基因上調(diào)，而與免疫抑制和未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)相關(guān)的基因下調(diào)。

甲基胞嘧啶二氧酶（TET2）在最近的研究中證明可以有效調(diào)節(jié)CD19.CAR T細(xì)胞。因此，作者研究了TET2的潛在作用。如圖4 E–I，敲除B7-H3.CAR T細(xì)胞的TET2后，CAR T細(xì)胞釋放的四種細(xì)胞因子GM-CSF，IFN-γ，IL-2, TNF-α增多，細(xì)胞的毒性活性增加，釋放的穿孔素和顆粒酶B也增多。因此，SAHA可以通過上調(diào)蛋白轉(zhuǎn)運信號通路增加T細(xì)胞表面B7-H3.CAR的表達(dá)。此外，SAHA還會影響B(tài)7-H3.CAR T細(xì)胞中細(xì)胞毒性機制的關(guān)鍵成分TET2。

圖4：SAHA上調(diào)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運信號通路和減少免疫抑制分子的表達(dá)，例如CTLA-4和TET2，圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors

五、SAHA可增強異種移植模型中B7-H3.CAR T細(xì)胞的抗腫瘤活性

作者用體內(nèi)實驗測試SAHA和B7-H3聯(lián)合治療，首先建立第0代（P0）小鼠原位細(xì)胞系。如圖5，在CAR T細(xì)胞注入后的第30天，聯(lián)合治療顯著控制了腫瘤的生長，聯(lián)合治療組的凋亡癌細(xì)胞百分比、B7-H3表達(dá)水平和腫瘤浸潤T細(xì)胞數(shù)也最高，在SAHA和B7-H3.CAR T細(xì)胞治療組中也發(fā)現(xiàn)了比其他組更具浸潤性的生成IFNγ的T細(xì)胞。

圖5：SAHA和B7-H3聯(lián)合的CAR-T細(xì)胞在TNBC和HNSCC異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出良好的腫瘤控制作用。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

六、結(jié)論

綜上所述，作者從人源化mab 8H9中獲得B7-H3.CAR T細(xì)胞，篩選了組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)SAHA介導(dǎo)可以上調(diào)B7-H3在實體癌細(xì)胞中的表達(dá)以及B7-H3.CAR T細(xì)胞在人T細(xì)胞中的表達(dá)。SAHA和B7-H3.CAR T細(xì)胞的聯(lián)合后對多種類型的人實體癌的抗腫瘤活性增加。

重頭戲來了!

在這篇高分文獻(xiàn)中，作者在異體移植模型中分析腫瘤浸潤性的生產(chǎn)IFNγ的T細(xì)胞，采用的是酶聯(lián)免疫斑點法去定量生產(chǎn)IFNγ的T細(xì)胞。采用的試劑盒是達(dá)科為的達(dá)優(yōu)系列Human IFN-γ Precoated ELISPOT Kit（cat#2110001和cat# 2110005），如下圖。

 

產(chǎn)品介紹

達(dá)科為公司的達(dá)優(yōu)^?系列Human IFN-γ Precoated ELISPOT Kit采用原裝進(jìn)口高親和力高效價抗體對，經(jīng)預(yù)包被PVDF板、低溫干燥、真空密封包裝等工藝流程制備。成品PVDF板上預(yù)包被的抗體分布均勻、效價穩(wěn)定，實驗檢測時間從3天縮短為2天，大幅度減少無菌操作的實驗步驟，減輕實驗者的勞動強度和減少污染的幾率，使得實驗者能夠輕松、高效地完成復(fù)雜的ELISPOT檢測實驗。

■ 應(yīng)用范圍：本試劑盒專用于科研。

■ 保存條件：2-8℃可穩(wěn)定保存12個月。

齊全的產(chǎn)品

達(dá)優(yōu)系列ELISPOT試劑盒分人和小鼠兩種種屬，涵蓋多種指標(biāo)，有可拆卸和不可拆卸板條；并且也提供ELISPOT的輔助試劑和讀板服務(wù)，為您的ELISPOT實驗保駕護(hù)航。

參考文獻(xiàn)：

Lei, Xinyuan, et al. A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3–Specific CAR T Cells in Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 2021.

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