• 試劑、耗材的準備（板子平衡至室溫，buffer的稀釋，標準品的溶解等）；
• 捕獲抗體的包被（通常為4°C過夜）；
• 洗板，洗去未結合的抗體；
• 封閉，占據未被捕獲抗體結合的空隙（有些試劑盒不需要封閉）；
• 洗板，洗去未結合的封閉劑；
• 加入樣本或標準品（孵育時間參考說明書）；
• 加入檢測抗體（孵育時間參考說明書） ；
• 洗板，洗去未結合的檢測抗體；
• 加入酶標記的二抗（孵育時間參考說明書） ；
• 洗板，移除多余的二抗；
• 加入底物顯色（參考說明書，具體時間根據實驗情況調整）；
• 加入終止液終止顯色（終止后迅速檢測）；
• u 酶標儀測吸光值（雙波長檢測更準確，450nm檢測波長，570nm校正波長）。

1、樣本中分析物水平較低可以使用哪些方法改進檢測？

通過增加洗滌次數和兩次洗滌之間的浸泡時間降低背景。

控制測定精確度。例如，在移液時要更加小心和一致，使用干凈的紙巾拍板，以避免污染。

增加孵育時間。但這通常也會增加背景，因此檢測靈敏度不一定會增加。

如果可以的話，建議濃縮樣本。

使用5-PL曲線擬合方法，更準確地計算標準曲線下端的樣本濃度。

在大多數情況下，樣本可能只含有非常低或無法檢測到的分析物水平。這時無論如何操作和測定，仍然無法檢測到準確濃度。

2、包板應如何存放？

如果包被完抗體的板不能立即使用，應將其密封并在4°C儲存過夜。

3、為什么使用同一克隆號的捕獲抗體和檢測抗體建立ELISA實驗沒有成功？

如果使用相同的克隆抗體進行檢測和捕獲，則抗原表位可能已經被其中一種抗體占據并抑制另一抗體結合。建議捕獲和檢測抗體選擇不同的克隆號。

4、應該使用哪種包被緩沖液？

一般來說，建議使用PBS（pH 7.4）或碳酸鹽緩沖液（pH 9.5）。確切的包被緩沖液可能取決于要檢測的細胞因子。

5、為什么細胞因子流式染色與ELISA測定之間沒有良好的相關性？

流式細胞術檢測的胞內細胞因子代表檢測時的陽性細胞比例，ELISA代表細胞因子隨時間的積累量。可能少量的陽性細胞在一段時間之后會分泌大量的細胞因子于培養上清中,導致ELISA的結果與胞內因子染色的結果不一致

6、可以使用細胞培養板進行ELISA實驗嗎？

不可以。細胞培養板設計用于達到細胞培養目的，通常不具有高蛋白結合能力。對于ELISA，建議使用具有高蛋白結合能力的板，例如 Nunc Maxisorp?酶標板。

7、血清等樣本可以重復使用嗎？

不建議重復使用樣本。為了獲得準確的結果，樣本應分裝儲存，僅供一次性使用。如果重復使用樣本，需要進行額外的驗證實驗，以確保實驗準確性。

8、在什么步驟中，可以暫停ELISA實驗？可以冷凍板子以備后用嗎？

最好遵循說明書操作，沒有任何可以暫停實驗的步驟。但是，如果一定需要暫停實驗，建議在封閉步驟（包被捕獲抗體后）。可以在孔中加入200 μL封閉緩沖液，并將板在4°C過夜（信號損失最小或沒有）或在-20°C冷凍幾天（可能會對信號產生一些影響）。不建議在第一步進行（在4°C用捕獲抗體包被超過16-20小時），因為可能會導致高背景。

9、包被捕獲抗體可以超過過夜的時間嗎？

通常來說，建議在4°C包被16-20小時。較長的孵育時間可能會增加與板結合的捕獲抗體量，會增加背景。

10、培養基中的酚紅會干擾ELISA測定嗎？

不會，培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會干擾ELISA測定的讀數。

11、對于一些ELISA試劑盒，為什么血清樣本需要稀釋？

血清樣本稀釋可以盡量減少樣本和標準品之間的基質差異，以獲得更加準確的結果。

12、如何提高ELISA檢測獲得更好的信號和靈敏度？

增加孵育時間，但這也可能會增加檢測的背景，同時不改變靈敏度。

在孵育步驟中搖動板子。

確保標準品在使用前完全溶解。

在兩次洗滌之間增加浸泡時間，以進一步降低背景。

如果可以的話，在450-570 nm處讀板以減去本底。

通過控制移液誤差或使用更大體積的洗滌緩沖液洗滌來改善CV值。

使用5-PL或4-PL曲線擬合方法，而不是線性曲線擬合。